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Trennung erwünscht

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Mit der Dünnschichtchromatographie (DC) kann man ohne großen apparativen Aufwand die Reinheit eines Stoffes oder seine Identität durch Vergleich mit einer Referenzsubstanz überprüfen.

Es handelt sich um ein physikalischchemisches Trennverfahren, das auf Transportprozessen durch eine mobile flüssige Phase entlang einer stationären festen Phase beruht. Oder anders ausgedrückt: Eine mobile Phase, also eine Flüssigkeit, die an der stationären Phase hochsteigt, nimmt die einzelnen Bestandteile eines Stoffgemisches unterschiedlich weit mit, sodass es sich auftrennt und man die einzelnen Komponenten sehen kann. 

Ausrüstung Man benötigt dazu eine DC-Kammer, in der sich das Ganze abspielt und eine Dünnschichtchromatographieplatte oder -karte, auf der die stationäre Phase in dünner Schicht aufgebracht ist. Die Platten sind meist mit Kieselgel beschichtet, das sind Polykieselsäuremoleküle, die an ihrer Oberfläche viele polare OHGruppen enthalten.

Als mobile Phase, die man auch Lauf- oder Fließmittel nennt, wird eine Flüssigkeit verwendet, die die Fähigkeit besitzt, an der stationären Phase durch Kapillarkräfte hochzusteigen. Weder der zu untersuchende Stoff noch die Beschichtung der DCPlatte dürfen sich darin lösen.

Kammersättigung Die Chromatographiekammer besteht in der Regel aus Glas und hat einen dicht schließenden Deckel. Ganz entscheidend für eine gute „Entwicklung“ des Chromatogramms ist die Kammersättigung durch Fließmitteldämpfe vor dem Start. Laut Europäischem Arzneibuch soll die Kammer nach der Befüllung mit der mobilen Phase eine Stunde bei Raumtemperatur stehen, bevor man die Platte hineinstellt. Eine ungenügende Kammersättigung kann man häufig schon am sogenannten Randeffekt erkennen, also daran, dass die Substanzen am Rand der Platte höher laufen als in der Mitte.

Kleine Punkte Sorgfalt und eine ruhige Hand sind beim Auftragen der zu untersuchenden Substanz gefragt. Meist trägt man den gelösten Stoff mithilfe einer Kapillare durch mehrmaliges Auftupfen punktförmig als zwei bis fünf Millimeter großen Fleck auf einer Linie auf, die parallel zur Unterkante der Platte verläuft.

Zwischen zwei Flecken sollte ein ausreichend großer Abstand von mindestens einem Zentimeter und außerdem ein ausreichender Abstand zum Rand der Platte eingehalten werden. Je kleiner der Punkt, umso schneller und effektiver trennt sich das Gemisch auf. Wichtig ist beim Auftragen, dass man das Auftupfen erst dann wiederholt, wenn der vorherige Tropfen vollständig getrocknet ist. Dies kann man mit einem Föhn beschleunigen.

Entwicklung und Detektion Wenn die Platte in die Kammer gestellt wird, darf die Auftragslinie niemals in das Fließmittel eintauchen. Die Kammer sollte möglichst nicht mehr bewegt und der Deckel sofort wieder geschlossen werden. Hat das Fließmittel die obere Kante der Platte fast erreicht, ist die Entwicklung abgeschlossen und die Platte wird aus der Kammer genommen und getrocknet.

Sie darf nicht länger in der Kammer bleiben, sonst werden die Flecken diffusionsbedingt größer. Manche Substanzen kann man nun direkt auf der Platte sehen, andere müssen erst noch detektiert werden. Dies erfolgt meist unter UV-Licht bei 254 oder 365 Nanometer Wellenlänge. Dazu werden Platten verwendet, bei denen bereits ein Fluoreszenzindikator enthalten ist. Die unbenutzte Platte fluoresziert unter der UV-Lampe.

Nach der Entwicklung wird an den Stellen, wo sich Substanzen befinden, der Indikator überlagert und es sind dunkle Flecken zu erkennen. Man nennt dies Fluoreszenzlöschung. Manchmal muss vor der Auswertung der Platte auch noch ein Reagenz aufgesprüht werden. Um die einzelnen entstandenen Flecken zuzuordnen, arbeitet man in der Regel mit Referenzsubstanzen, also bekannten Reinsubstanzen, die man auf der Platte mitlaufen lässt.

Den Artikel finden Sie auch in die PTA IN DER SCHULE 2016 auf Seite 34.

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